PCRje polymerázová reťazová reakcia, ktorá označuje pridanie dNTP, Mg2+, elongačných faktorov a faktorov zosilňujúcich amplifikáciu do systému za katalýzy DNA polymerázy, pričom sa ako templát používa rodičovská DNA a ako východiskový bod predlžovania sú špecifické priméry, Prostredníctvom krokov denaturácie, anelácie, predlžovania atď. môže proces in vitro replikácie dcérskeho vlákna DNA komplementárneho k templátovej DNA rodičovského vlákna rýchlo a špecificky amplifikovať akúkoľvek cieľovú DNA in vitro.
1. Hot Start PCR
Čas začiatku amplifikácie pri konvenčnej PCR nie je vložiť zariadenie PCR do zariadenia PCR a potom program začne amplifikovať.Po dokončení konfigurácie systému sa začne amplifikácia, ktorá môže spôsobiť nešpecifickú amplifikáciu, a tento problém môže vyriešiť hot-start PCR.
Čo je hot start PCR?Po príprave reakčného systému sa modifikátor enzýmu uvoľní pri vysokej teplote (zvyčajne vyššej ako 90 °C) počas počiatočného zahrievacieho štádia reakcie alebo štádia „hot start“, takže sa aktivuje DNA polymeráza.Presný čas aktivácie a teplota závisia od povahy DNA polymerázy a modifikátora horúceho štartu.Táto metóda využíva hlavne modifikátory, ako sú protilátky, afinitné ligandy alebo chemické modifikátory na inhibíciu aktivity DNA polymerázy.Keďže aktivita DNA polymerázy je inhibovaná pri izbovej teplote, technológia horúceho štartu poskytuje veľké pohodlie pri príprave viacerých reakčných systémov PCR pri izbovej teplote bez obetovania špecifickosti reakcií PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) je experimentálna technika na reverznú transkripciu z mRNA do cDNA a jej použitie ako templátu na amplifikáciu.Experimentálnym postupom je najprv extrahovať celkovú RNA v tkanivách alebo bunkách, použiť Oligo (dT) ako primér, použiť reverznú transkriptázu na syntézu cDNA a potom použiť cDNA ako templát na PCR amplifikáciu na získanie cieľového génu alebo detekciu génovej expresie.
3. Fluorescenčná kvantitatívna PCR
Fluorescenčná kvantitatívna PCR (Kvantitatívna PCR v reálnom čase,RT-qPCR) označuje metódu pridávania fluorescenčných skupín do reakčného systému PCR, pričom sa využíva akumulácia fluorescenčných signálov na monitorovanie celého procesu PCR v reálnom čase a nakoniec sa na kvantitatívnu analýzu templátu používa štandardná krivka.Bežne používané metódy qPCR zahŕňajú SYBR Green I a TaqMan.
4. Nested PCR
Nested PCR označuje použitie dvoch sád PCR primérov pre dve kolá PCR amplifikácie a amplifikačný produkt druhého kola je cieľový génový fragment.
Ak nesúlad prvého páru primérov (vonkajších primérov) spôsobí amplifikáciu nešpecifického produktu, možnosť, že tá istá nešpecifická oblasť bude rozpoznaná druhým párom primérov a bude pokračovať v amplifikácii, je veľmi malá, takže amplifikáciou pomocou druhého páru primérov sa zlepšila špecificita PCR.Jednou z výhod uskutočnenia dvoch kôl PCR je, že pomáha amplifikovať dostatočné množstvo produktu z obmedzenej východiskovej DNA.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR je metóda na zlepšenie špecifickosti reakcie PCR úpravou parametrov cyklu PCR.
Pri touchdown PCR je teplota žíhania pre prvých niekoľko cyklov nastavená niekoľko stupňov nad maximálnou teplotou žíhania (Tm) primérov.Vyššia teplota nasadenia môže účinne znížiť nešpecifickú amplifikáciu, ale súčasne vyššia teplota nasadenia zhorší separáciu primérov a cieľových sekvencií, čo vedie k zníženiu výťažku PCR.Preto sa v prvých niekoľkých cykloch teplota žíhania zvyčajne nastaví tak, aby sa znížila o 1 °C na cyklus, aby sa zvýšil obsah cieľového génu v systéme.Keď sa teplota žíhania zníži na optimálnu teplotu, teplota žíhania sa udržiava počas zostávajúcich cyklov.
6. Priama PCR
Priama PCR označuje amplifikáciu cieľovej DNA priamo zo vzorky bez potreby izolácie a purifikácie nukleovej kyseliny.
Existujú dva typy priamej PCR:
priama metóda: odoberte malé množstvo vzorky a pridajte ju priamo do PCR Master Mix na identifikáciu PCR;
metóda krakovania: po vzorkovaní vzorky pridajte do lyzátu, lyzujte, aby sa uvoľnil genóm, odoberte malé množstvo lyzovaného supernatantu a pridajte ho do PCR Master Mix, vykonajte PCR identifikáciu.Tento prístup zjednodušuje experimentálny pracovný postup, skracuje čas potrebný na prácu a zabraňuje strate DNA počas purifikačných krokov.
7. SOE PCR
Génový zostrih pomocou prekrývacej predlžovacej PCR (SOE PCR) využíva priméry s komplementárnymi koncami, aby produkty PCR tvorili prekrývajúce sa reťazce, takže v následnej amplifikačnej reakcii, prostredníctvom predĺženia prekrývajúcich sa reťazcov, môžu vzniknúť rôzne zdroje techniky A, v ktorej sa amplifikované fragmenty prekrývajú. a spojené dohromady.Táto technológia má v súčasnosti dva hlavné aplikačné smery: konštrukcia fúznych génov;génová miestne cielená mutácia.
8. IPCR
Inverzná PCR (IPCR) využíva reverzné komplementárne priméry na amplifikáciu fragmentov DNA iných ako dva priméry a amplifikuje neznáme sekvencie na oboch stranách známeho fragmentu DNA.
IPCR bol pôvodne navrhnutý na určenie sekvencie susediacich neznámych oblastí a väčšinou sa používa na štúdium sekvencií génových promótorov;onkogénne chromozomálne preskupenia, ako je génová fúzia, translokácia a transpozícia;a integrácia vírusového génu, sa teraz tiež bežne používajú. Na miestne cielenú mutagenézu skopírujte plazmid s požadovanou mutáciou.
9. dPCR
Digitálna PCR (dPCR) je technika absolútnej kvantifikácie molekúl nukleových kyselín.
V súčasnosti existujú tri metódy na kvantifikáciu molekúl nukleových kyselín.Fotometria je založená na absorbancii molekúl nukleových kyselín;fluorescenčná kvantitatívna PCR v reálnom čase (PCR v reálnom čase) je založená na hodnote Ct a hodnota Ct sa vzťahuje na číslo cyklu zodpovedajúce hodnote fluorescencie, ktorú možno detegovať;digitálna PCR je najnovšia Kvantitatívna technológia založená na metóde PCR s jednou molekulou na počítanie nukleových kyselín. Kvantifikácia je absolútna kvantitatívna metóda.
Čas odoslania: 13. júna 2023