Použitie a bezpečnostné opatrenia ultrafiltračnej centrifugačnej skúmavky
1) Vyberte si vhodnú ultrafiltračnú trubicu.Všimnite si, že UF membrány sa líšia úrovňou tolerancie voči rôznym chemikáliám.Typicky môžu byť ultrafiltračné skúmavky s medznou hodnotou molekulovej hmotnosti 10 kDa vybrané s medznou hodnotou molekulovej hmotnosti, ktorá by nemala byť väčšia ako 1/3 molekulovej hmotnosti požadovaného proteínu, ako je napríklad 35 kDa.Ak je molekulová hmotnosť proteínu, ktorý je predmetom záujmu, okolo 10 kd, môže sa použiť ultrafiltračná skúmavka s limitom molekulovej hmotnosti 3 kD.
(2) Ultrafiltrácia, čerstvo zakúpená, je suchá, s ultračistou vodou pridanou pred použitím a voda úplne prejde cez membránu, ľadový kúpeľ alebo chladničku predchladenú na niekoľko minút.Potom sa voda, tj bielkovinová tekutina, vyleje a koľko sa pridá, podľa toho, čo nie je viac ako biela čiara na vrchu skúmavky.Prevádzka je nenáročná a ultrafiltračná trubica sa musí pred pridaním proteínového roztoku vopred ochladiť na ľade.
3) Hmotnosť aj ťažisko mali dosiahnuť rovnováhu.Upozorňujeme, že rýchlosť otáčania a zrýchlenie nie sú príliš rýchle, inak priamo poškodzujú ultrafiltračnú membránu.Začala sa odstredivá ultrafiltrácia (centrifúga vopred ochladená na 4 stupne).Po premene otáčok rôznych centrifúg na g to bolo iné.Zrýchlenie centrifúgy bolo nastavené na minimum, čím sa znížil tlak na membránu.Všimnite si, že odstredivku opustite potom, čo odstredivka dosiahne cieľovú rýchlosť, alebo ak máte problém, nemôžete ho zvládnuť na prvýkrát.Orientácia membrány na vreteno bola upravená podľa pokynov (uhlové puzdro odstredivky je kolmé na membránu).Pri praktickom použití je všeobecná rýchlosť otáčania nižšia ako v návode, takže životnosť centrifugačnej skúmavky sa môže predĺžiť.
3) Hmotnosť aj ťažisko mali dosiahnuť rovnováhu.Upozorňujeme, že rýchlosť otáčania a zrýchlenie nie sú príliš rýchle, inak priamo poškodzujú ultrafiltračnú membránu.Spustila sa odstredivá ultrafiltrácia (centrifúga vopred ochladená na 4 stupne).Po premene otáčok rôznych centrifúg na g to bolo iné.Zrýchlenie centrifúgy bolo nastavené na minimum, čím sa znížil tlak na membránu.Všimnite si, že odstredivku opustite potom, čo odstredivka dosiahne cieľovú rýchlosť, alebo ak máte problém, nemôžete ho zvládnuť na prvýkrát.Orientácia membrány na vreteno bola upravená podľa pokynov (uhlové puzdro odstredivky je kolmé na membránu).Pri praktickom použití je všeobecná rýchlosť otáčania nižšia ako v návode, takže životnosť centrifugačnej skúmavky sa môže predĺžiť.
(4) Po zahustení na zostávajúci 1 ml odoberte 50 ul tlmivého roztoku, pridajte 10 ul pretečeného roztoku a zistite, či je nejaké modré sfarbenie, aby ste mohli posúdiť, či v ultrafiltračnej skúmavke chýba proteín.Ak je trubica netesná, znova nalejte hornú vrstvu a pretečte do novej trubice, aby sa začala ultrafiltrácia.Aby ste presne určili, či sa vynechali skúmavky, centrifugujte 10 minút s 5 mg ml BSA pred prietokom, bežte na proteínovom lepidle alebo Bradfordovom surovom teste a pokračujte pridávaním zvyšného koncentrovaného proteínového roztoku (ktorý funguje na ľade a zabraňuje zahrievaniu proteínov), kým bol pridaný všetok koncentrát.Počas odstreďovania dávajte pozor, aby nedošlo k vyzrážaniu proteínov, čo by viedlo k uzavretiu skúmavky.Ak dôjde k zrážaniu, určite, či je špecifickou príčinou zrážania nadmerná koncentrácia proteínu alebo nevhodný pufor;Prvý môže byť vyriešený ultrafiltráciou viacerých ultrafiltračných skúmaviek súčasne, znížením koncentrácie, a druhý môže byť vyriešený výmenou rôznych tlmivých roztokov, kým nenastane zrážanie proteínu.
(4) Po zahustení na zostávajúci 1 ml odoberte 50 ul tlmivého roztoku, pridajte 10 ul pretečeného roztoku a zistite, či je nejaké modré sfarbenie, aby ste mohli posúdiť, či v ultrafiltračnej skúmavke chýba proteín.Ak je trubica netesná, znova nalejte hornú vrstvu a pretečte do novej trubice, aby sa začala ultrafiltrácia.Aby ste presne určili, či sa vynechali skúmavky, centrifugujte 10 minút s 5 mg ml BSA pred prietokom, bežte na proteínovom lepidle alebo Bradfordovom surovom teste a pokračujte pridávaním zvyšného koncentrovaného proteínového roztoku (ktorý funguje na ľade a zabraňuje zahrievaniu proteínov), kým bol pridaný všetok koncentrát.Počas odstreďovania buďte opatrní, ak dôjde k precipitácii proteínov, čo vedie k uzavretiu skúmavky.Ak dôjde k zrážaniu, určite, či je špecifickou príčinou zrážania nadmerná koncentrácia proteínu alebo nevhodný pufer;Prvý môže byť vyriešený ultrafiltráciou viacerých ultrafiltračných skúmaviek súčasne znížením koncentrácie a druhý môže byť vyriešený výmenou rôznych tlmivých roztokov, kým nedôjde k precipitácii proteínu.
(5) Prvých niekoľko krokov sa používa na zahustenie proteínu a ak sa má zmeniť pufor, jemne pridajte nový pufor (ultrafiltrácia cez 0,22 um ultrafiltračnú membránu) do približne 1 ml celkového proteínu a znova zahustite na približne 1 ml na tri po sebe idúce časy, pričom konečný koncentrovaný konečný objem závisí od požadovanej koncentrácie proteínu, vo všeobecnosti nie viac ako 500 ul, ale tiež do 200 ul.Dosiahnite 1000-násobok alebo viac pri troch príležitostiach, v podstate toľko výmeny tlmivého roztoku, ako sa vypočíta pri najmenej 10-násobnom alebo takom obohatení objemu zakaždým.
(5) Prvých niekoľko krokov sa používa na zahustenie proteínu a ak sa má zmeniť pufor, jemne pridajte nový pufor (ultrafiltrácia cez 0,22 um ultrafiltračnú membránu) do približne 1 ml celkového proteínu a znova zahustite na približne 1 ml na tri po sebe idúce časy, pričom konečný koncentrovaný konečný objem závisí od požadovanej koncentrácie proteínu, vo všeobecnosti nie viac ako 500 ul, ale tiež do 200 ul.Dosiahnite 1000-násobok alebo viac pri troch príležitostiach, v podstate toľko výmeny tlmivého roztoku, ako sa vypočíta pri najmenej 10-násobnom alebo takom obohatení objemu zakaždým.
Čas uverejnenia: 9. novembra 2022